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Tests de laboratoire

Les bioessais ont pour but:

- d’évaluer la dangerosité d’une ou plusieurs substances : ce peut être un polluant que l’on trouve dans les milieux naturels (ex : un pesticide) ou un nouveau produit industriel dont on souhaite connaitre les effets potentiels sur l’environnement (ex : un conservateur de produits cosmétiques)

- d’évaluer la qualité d’un milieu : par exemple, si un sol a été pollué aux métaux lourds à cause d’une usine, on souhaite savoir si la pollution de ce sol est dangereuse pour la faune qui y vit (vers de terre etc.)

- de comprendre les mécanismes d'action d'un polluant : étude de la bioaccumulation d'une substance (= faculté à s'accumuler dans les tissus d'un organisme), compréhension des phénomène de toxicité du polluant, etc.

Quel est l’avantage d’un bioessai par rapport à une analyse chimique classique ?

Une analyse chimique donne les concentrations de différents polluants dans un échantillon : par exemple, elle pourra dire qu’une rivière a une teneur de 0.2µg/l en DDT (un pesticide). Par contre, elle ne pourra pas dire si le DDT est biodisponible, c'est-à-dire, s’il est assimilable par les organismes vivants, et si ce polluant peut les affecter. A l’inverse, en réalisant un « test daphnie », on met en contact un échantillon de l’eau de la rivière avec des organismes et on observe la toxicité sur le crustacé. De plus, quels polluants analyser lors d’une analyse chimique ? on peut en oublier ou au contraire en analyser certains qui ne sont pas présents, ce qui coûte cher. Au contraire, lors d’un test écotox’ peu importe le polluant, seul l’effet est évalué.


Cette rubrique présente les notions essentielles d'un bioessai de laboratoire. Elle décrit également les essais les plus couramment utilisés, notamment lors de l'évaluation de la toxicité d'une substance ou d'un prélèvement. Enfin, elle présente d'autres types d'expérimentations de laboratoire destinées davantage à la recherche scientifique.



Un bioessai consiste à exposer un organisme vivant (ou une cellule) à une substance dont on souhaite évaluer la toxicité. Cette substance peut être ingérée (la substance est ajoutée dans la nourriture), injectée directement dans l'animal, inhalée (c'est à dire respirée) ou encore se trouver dans le milieu de vie de l'organisme (par exemple dans l'eau d'un aquarium). Par exemple, cela peut consister à disposer plusieurs aquariums contenant des poissons et de l'eau avec différentes quantités d'un polluant. Un des aquariums ne contient pas de polluant : c'est le témoin qui sert de référence pour détecter d'éventuels effets du polluant.

Expérience visant à évaluer les effets d'un polluant sur une espèce de poisson

Ce test peut permettre de révéler :

- une toxicité aigüe du composé testé : c'est à dire une toxicité à court terme

- une toxicité chronique du composé testé : c'est à dire des effets à long terme du produit

Il est important de noter que la notion de toxicité aigüe ou chronique est relative à la durée de vie de l'organisme testé. Ainsi, une durée de test de 14 jours chez le ver de terre et de 24h chez la daphnie correspondent tout deux à une évaluation de la toxicité aigüe.

Dans notre exemple, nous allons prendre le cas d'une toxicité chronique : au bout d'1 mois, les oeufs pondus par les poissons et le nombre de décès seront comptés. Le schéma ci-dessous permet de comprendre comment une expérience peut permettre la détermination des valeurs de référence d'un test écotoxicologique : la CE 50, la NOEC et la LOEC.

Si on s'intéresse aux décès des poissons, on peut déterminer une CL50 (Concentration Léthale 50%) : la concentration en polluant qui tue 50% des individus en un temps donné.

Ces valeurs de référence que sont les NOEC, LOEC et CE50 sont très utiles car elles permettent de déterminer les normes de rejet des différents produits potentiellement polluants (voir la page "méthode d'évaluation du risque").



D’après une livre de Calow de 1993, un bon test écotoxicologique doit respecter la règle des 5R (en anglais) :

-Relevance : ce qui signifie réalisme, pertinence, représentativité. L’organisme vivant choisi pour le test doit être représentatif du milieu évalué : ex un ver de terre représente bien les organismes du sol puisqu’il est très présent et très important dans la « vie d’un sol »

-Reliability : fiabilité. Une méthode fiable peut être utilisée à n’importe quel moment.

-Repeatability : répétabilité. Lorsque le test est répété, il doit donner des résultats qui varient peu.

-Reproducibility : reproductibilité. Si différents laboratoires à travers le monde réalisent le test sur une même substance, ils doivent trouver des résultats voisins.

-Robustness : robustesse. Une méthode robuste est susceptible d’être utilisée par n’importe quel technicien moyennement entraîné ou formé.

Bien sûr, chacun des tests présentés ici ne possède pas l’ensemble des qualités ci-dessus. Cependant, il sont couramment utilisés, notamment en raison de leur rapidité et de leur relative facilité d’exécution. Ils ont également l'avantage d'être standardisés : des normes décrivent le protocole exact de ces tests, permettant ainsi de pouvoir comparer les résultats obtenus dans les laboratoires du monde entier. Des kits de tests ont même été mis au point par la société EBPI : ils contiennent tout le matériel nécessaire à la réalisation d'un test, y compris les organismes.

Ces tests sont utilisés pour évaluer la toxicité d'une substance (par exemple un nouveau composé qui va être mis sur le marché) ou d'un prélèvement (par exemple un prélèvement de sol de friche industriel potentiellement pollué aux métaux lourds).



Essau de toxicité aigûe (à court terme)

Essai de mobilité de daphnies (norme ISO 6341)

Les tests utilisant des daphnies sont les plus utilisés en écotoxicologie, du fait notamment, de leur facilité d’utilisation.
Ce test a pour objectif d'évaluer la toxicité aiguë du produit testé pour la faune aquatique (micro-crustacés). Ce test permet de déterminer la concentration du produit testé qui, en 24 h, immobilise 50 % des daphnies (Daphnia magna) mises en expérimentation (concentration efficace initiale inhibitrice, CE 50i - 24 h).
  Une daphnie (aquaportail.com, 2011)

Pour en savoir plus et consulter le protocole détaillé du test, cliquer ici.


Test microtox (norme NF EN ISO 11348-3 (1999))

Il permet d'évaluer la toxicité aigüe d’un ou de plusieurs produits vis-à-vis des bactéries. Vibrio fischeri, la bactérie marine utilisée dans ce test, émet naturellement des photons (= lumière). En présence de toxiques, son métabolisme (=ensemble des dépenses énergétiques) est affecté, ce qui se traduit par une chute de sa luminescence (émission lumineuse). En utilisant cette propriété, ce test permet donc de déterminer la concentration du produit testé qui diminue de 50 % le métabolisme de la bactérie étudiée (CI 50).
  La bactérie marine Vibrio fischeri (pnas.org, 2011)

Pour en savoir plus et consulter le protocole détaillé du test, cliquer ici.


Test de survie des poissons :

Ce test vise à évaluer la toxicité aigüe de produits sur une espèce de poisson d’eau douce (le poisson zèbre Danio rerio) à différents stades de son développement. Ainsi, les concentrations en polluants induisant une mortalité de 50 % des individus (CL50) peuvent être déterminées pour les poissons adultes mais aussi pour les œufs de poissons.
Le poisson zèbre Danio rerio (aquaportail.com, 2011)

Pour en savoir plus et consulter le protocole détaillé du test, cliquer ici.


Test de toxicité chronique (à long terme)

Essai de reproduction de daphnies (norme OCDE 211.1998) :

Ce test évalue la toxicité chronique (à long terme) du produit testé pour la faune aquatique (micro-crustacés). Il consiste à mesurer la reproduction (nombres de jeunes produits) de daphnies exposées à différentes concentrations d'un composé après 21 jours d'expérimentation. Comme l'ensemble des essais de toxicité chronique, ce test s'intéresse en particulier à la NOEC (No Observed Effect Concentration) et à la LOEC (Lowest Observed Effect Concentration):

-la NOEC: dans ce test, c'est la plus forte concentration testée où la reproduction des daphnies n’est pas différente de celle des témoins
-LA LOEC: dans ce test, c'est la plus faible concentration testée où la reproduction des daphnies est statistiquement différente de celle des témoins

Pour en savoir plus et consulter le protocole détaillé du test, cliquer ici.


Test algues (norme AFN0R T90-304 (mai 2005)) :

Ce test vise à évaluer la toxicité chronique du produit testé pour la flore aquatique. Il consiste à mesurer la croissance (sous microscope) de l'algue d'eau douce Pseudokirchneriella subcapitata après 72h d'exposition au produit ou au prélèvement d'eau testé : certains composés auront pour effet d'inhiber la croissance de l'algue, révélant ainsi leur toxicité vis à vis des végétaux aquatiques.

L'algue d'eau douce Pseudokirchneriella subcapitata
L'algue d'eau douce Pseudokirchneriella subcapitata (chaque croissant correspond à un individu) (ecotox.ca, 2011)

Pour en savoir plus et consulter le protocole détaillé du test, cliquer ici.




Différents tests permettent d’évaluer la toxicité de polluants sur les organismes terrestres tels que les animaux vivant dans le sol (vers de terre, collemboles, etc.) ou les végétaux.

Test vers de terre (normes ISO 11268.1 (1998) et ISO 11268.2 (1993)) :

Il existe deux tests vers de terre : l'un évalue la toxicité aigüe (court terme) et l'autre la toxicité chronique (long terme). Pour le premier, on évaluera la mortalité de vers de terre exposés, pendant 14 jours, à un sol pollué : on déterminera la concentration léthale pour 50 % des individus (CL50). Pour le second, on déterminera les effets à long terme (4 à 8 semaines) de polluants sur la reproduction des organismes : on s'interessera à la concentration sans effet sur la reproduction (NOEC). Pour ces deux tests, on utilisera l'espèce de vers de terre Eisenia fetida.
Pour en savoir plus et consulter le protocole détaillé du test, cliquer ici.
Vous pouvez également regarder une illustration vidéo en cliquant ici.
Le ver de terre Eisenia fetida (worm-farm.co.za , 2011)


Tests végétaux :

Différents tests permettent d’évaluer la toxicité de polluants présents dans le sol sur la germination, la croissance ou l’élongation racinaire de végétaux.

(allodefi.com, 2011)



Ces tests évaluent la toxicité de polluants sur l’ADN (génotoxicité) et leur faculté à induire un cancer chez un organisme (cancèrogénicité).

Essai des comètes :

L'essai des comètes permet de mesurer les cassures de l'ADN (molécule support de l'information génétique) induites par un polluant, qu'on appellera alors agent génotoxique. Après application d'une technique particulière appelée électrophorèse, les noyaux dont l’ADN a subi des cassures (dues à un polluant) prennent une forme de comète alors que les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds (voir photographie ci-dessous) (ifremer.fr, 2011).

Test des comètes : noyaux d'ADN sans cassure à gauche (témoin)
et avec cassure (queue de la comète) à droite (exposé à un produit génotoxique) (ifremer.fr, 2011)

Pour en savoir plus, cliquer ici.




Dans les différents laboratoires exerçant des activités de recherche en écotoxicologie (Cemagref, INERIS, etc.), les scientifiques réalisent des expériences plus complexes que les bioessais classiques. Ces expériences sont destinées non seulement à évaluer la toxicité de composés ou de prélèvements, mais aussi à comprendre les différents mécanismes responsables de cette toxicité : bioaccumulation des polluants, mécanismes de défense au sein de l'organisme, mécanismes d'action du ou des polluants, facteurs influençant cette toxicité (température, teneur en oxygène, âge de l'organisme, etc.), etc.

Pour mieux comprendre en quoi peuvent consister ces expériences, le plus simple est de décrire un exemple d'expérimentation :

Effets d'un mélange de perturbateurs endocriniens sur la reproduction d'un mollusque

Cette expérience consiste à exposer des mollusques à un mélange de perturbateurs endocriniens dont les concentrations ont été choisies pour être représentatives des teneurs retrouvées dans les eaux de surface.
Pour rappel, un perturbateur endocrinien est une substance pouvant affecter la reproduction, la croissance ou encore le développement d'un organisme vivant.

Pourquoi tester un mélange de molécules ?

Si on commence à mieux appréhender les effets des perturbateurs endocriniens lorsqu'un organisme est exposé à une seule de ces molécules, on connait beaucoup moins l'effet de ces composés lorsqu'ils sont présents en mélange. En effet, différentes études ont déjà montré que même si chacun des composés est présent à une concentration inférieure à celle où il induit un effet, le mélange de ces composés à ces mêmes concentrations peut néanmoins causer un effet (Silva, 2002).

Pour mieux comprendre ce phénomène, rien ne vaut un exemple. L'étude de Silva (graphique ci-dessous) a testé l'effet de 8 composés oestrogéniques (8 perturbateurs endocriniens) par un test particulier (le test YES) évaluant la puissance de l'effet perturbant (qu'on nomme "potentiel oestrogénique"). Les résultats de cette étude montrent que l'effet de chacun des composés pris séparément est pratiquement nul ("barres" 1 à 8). Si on fait, par calcul, la somme de ces effets, on arrive à un effet, là encore, très faible (barre "ES" sur le graphique). En revanche, on voit que si on mélange ces composés, l'effet de l'ensemble est beaucoup plus fort (barre "mix" sur le graphique). En mélange, on a donc parfois un effet "1+1=3". Mais on peut aussi observer le phénomène inverse : l'effet de plusieurs composés peut s'annuler. On a ainsi un effet 1+1=0.

Effets de composés oestrogéniques (perturbateurs endocriniens) mesurés par test YES (Silva, 2002)
1 à 8 : effets des composés testés individuellement
ES : somme arithmétique des effets individuels mesurés des 8 composés
CA : modèle de prédiction « addition des concentrations »
MIX : effets mesurés des composés testés en mélange

Par ailleurs, dans les milieux naturels, ces perturbateurs endocriniens sont toujours présents en mélange. Etudier l'effet de ces composés en mélange est donc plus "réaliste" que d'étudier l'effet de chacun de ces composés séparément.


Quelles molécules sont testées ?

Dans cette expérience, nous choisissons d'exposer le mollusque à 3 molécules : le Bisphénol A (BPA), l'Octylphénol (OP) et le Nonylphénol (NP).

Elles ont été choisies pour un ensemble de raisons:

-elles sont produites en grande quantité : le bisphénol A (un plastifiant), l'octylphénol et le Nonylphénol sont trois produits très utilisés par l'industrie.

-on les retrouve dans les milieux aquatiques : à des concentrations allant jusqu'à plusieurs dizaines de microgrammes par litre (Sharma, 2009)

-elles sont bioaccumulables : elles peuvent s'accumuler dans les tissus graisseux des organismes (Riva, 2010)

-ce sont des perturbateurs endocriniens: elles sont connues pour être des perturbateurs endocriniens chez les mammifères (Nakamura, 2002 ; Scott, 2000 ; Soto, 1991). Plusieurs études témoignent de leurs effets sur la reproduction des mollusques (on parle d'effets reprotoxiques) : comme le montre le graphique ci-dessous, une étude a ainsi mis en évidence une augmentation de la production d'embryons du mollusque Potamopyrgus antipodarum lorsqu'il est exposé à du Bisphénol A (Jobling, 2003).

Cette étude met en évidence une augmentation de la production d'embryons
chez le mollusque Potamopyrgus antipodarum exposé à du BPA (Jobling, 2003)

Quelle espèce sentinelle pour ce test?

Le mollusque Potamopyrgus antipodarum est choisi pour ces travaux de recherche pour plusieurs raisons :

-il est répandu dans un grand nombre d’habitats d’eau douce et saumâtre et il est donc représentatif de nombreux milieux (Winterbourn, 1970) ;

-c’est une espèce euryèce, c'est à dire tolérante à de nombreux stress : température, teneur en oxygène, taux de matière organique, etc. (Winterbourn, 1970) ;

-il est facile à élever et à transporter (OCDE, 2010) ;

-pas besoin d’accouplement et faible variabilité biologique : la quasi-totalité des individus européens sont des femelles et se reproduisent par parthénogénèse (Fretter et Graham, 1995) ;

-il est très sensible aux perturbateurs endocriniens avérés (BPA, OP, TBT, etc.) (Matthiessen, 2008).

Le mollusque Potamopyrgus antipodarum, choisi pour cette étude (advocacy.britannica.com, 2011)

 

Protocole de l'expérience

Cette expérience consiste à disposer des mollusques dans des béchers (= pots en verre) contenant de l'eau, de la nourriture (distribuée chaque jour) et le mélange des trois polluants (bisphénol a, octylphénol et nonylphénol) aux concentrations souhaitées. Ici, on teste différentes concentrations en polluants (dans différents béchers) choisies en fonction des concentrations en polluants que l'on trouve généralement dans les cours d'eau. Pour valider les résultats de l'expérience, certains béchers que l'on nommera "béchers témoins" seront également mis en place : ils contiennent uniquement les mollusques, l'eau et la nourriture (pas de polluants).

L'expérience durera plusieurs semaines, afin de mettre en évidence d'éventuels effets chroniques (long terme) du mélange de polluants sur les mollusques. Le dispositif d'installation est présenté dans la photographie ci-dessous:

Dispositif de l'expérience

Tout au long de l'expérience, différents paramètres sont suivis :

-la survie : on mesure tout au long de l'expérience le nombre de mollusques morts dans les "béchers témoins" et dans les béchers contenant le mélange de polluants. Un nombre de morts trop élevé dans les "béchers témoins" est le signe de conditions inadaptées aux mollusques (température, nourriture, etc.) et invalide les résultats de l'expérience.

-la reproduction : on mesure notamment le nombre d'embryons présents dans chacun des mollusques. Pour cela, on prélève, à différents "temps" de l'expérience, des mollusques dans chacun des béchers pour pouvoir comparer la reproduction des mollusques "témoins" et la reproduction des mollusques exposés aux polluants. On réalise ensuite une dissection et on compte les embryons non coquillés (formés récemment) et coquillés (formés il y a plus longtemps et prêts à être pondus).

Dissection et comptage des embryons sur le mollusque Potamopyrgus antipodarum

-la concentration des polluants dans les mollusques : afin d'évaluer la bioaccumulation (c'est à dire l'accumulation de polluants), des mollusques des différents béchers sont prélevés à différents temps de l'expérience. Les concentrations sont ensuite mesurées en utilisant des appareils de dosage chimique.

-d'autres paramètres, nécessaires à la compréhension des effets des polluants : les réserves énergétiques des mollusques (glucides, lipides, etc.), les stéroïdes (c'est à dire les hormones), l'histologie (visualisation des différents tissus des organismes sous microscope après coloration), etc.


Exploitation des résultats

Une fois que les différents paramètres ont été mesurés et que l'expérience est terminée, il faut structurer les résultats, les mettre en relation les uns avec les autres, les illustrer par des graphiques et réaliser des analyses statistiques.

On peut alors émettre des hypothèses pour expliquer ces résultats et les comparer à la littérature scientifique. Pour cette expérience, on peut ainsi comparer la reproduction en présence du mélange de polluants avec la reproduction des mollusques en présence d'un seul des polluants, afin de mettre en évidence un éventuel phénomène de synergie (1 + 1 = 3).

Enfin, on conclut sur l'ensemble des résultats et on évoque des perspectives à notre étude. Par exemple, quelles nouvelles expériences il faudrait réaliser pour confirmer ou infirmer nos hypothèses.



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